Investigation of the Role of Trimethylamine (TMA) and Trimethylamine-N-oxide (TMAO) as Inflammatory Mediators and their Impact on Human Health, with a Focus on Mitochondrial Dynamics. Evidence from both Observational Studies and in vitro Models.

The primary aim of the Ph.D. project was to deepen the understanding of the impact of two food- derived metabolites, i.e., trimethylamine (TMA) and trimethylamine N-oxide (TMAO), on human health. TMA and TMAO derive from the metabolism of certain dietary precursors by the activity of gut bacteria and their circulating levels have been associated with chronic diseases. However, this topic has not been fully elucidated yet, and a mechanistic explanation of this association is still missing. Hence, the present work has investigated the impact of TMA and TMAO of human health from different perspectives, each of which corresponds to a section of the manuscript. Since TMA and TMAO have been suggested to have an impact on mitochondrial dynamics, the first part of the project (Chapter 2) focused on the relationship between diet, TMA, TMAO, mitochondrial DNA copy number (mtDNAcn), and mitochondrial DNA methylation. Global DNA methylation was also investigated. Two hundred healthy subjects with extreme dietary patterns (healthy vs western diet) were recruited for the study. Their nutrients’ intake and diets’ quality (Healthy Eating Index) were assessed from their dietary records. Blood levels of TMA and TMAO, circulating levels of TMA precursors and their dietary intakes were also measured. MtDNAcn, nuclear DNA methylation in the long interspersed nuclear element 1 (LINE-1), and strand-specific D-loop methylation levels were assessed. The results showed that the TMAO/TMA ratio was negatively correlated with the D-loop methylation levels and positively correlated with mtDNAcn. Overall, these findings support the existence of a potential relationship between TMA metabolism and mitochondrial dynamics (and mtDNA), indicating a new avenue for further research. The second part of the project (Chapter 3) was aimed to investigate the impact of several environmental exposures (including diet, physical activity, and smoking) on biological age. Indeed, lifestyle factors are known to affect DNA methylation throughout life, either accelerating or decelerating the aging process. Epigenetic clocks are used to estimate the biological age of an individual by measuring methylation patterns in specific areas of the genome. Interestingly, a new epigenetic clock based on only 6 CpGs may represent an easily accessible tool to measure the epigenetic age (EA) of an individual. Hence, this study aimed to validate the 6 CpG epigenetic clock comparing it with other biomarkers of aging (such as telomere length (TL) and methylation in the long interspersed nuclear element-1 (LINE-1)). Moreover, the impact of lifestyle-associated factors (one-carbon (1 C) metabolism-related nutrients’ intake, circulating TMA and TMAO levels, body composition, physical activity, and smoking) on these molecular marks was also investigated. Two hundred healthy participants having extreme dietary patterns (healthy vs western diet) were selected. Dietary intakes, circulating TMA and TMAO levels, body composition, physical activity level and smoking habits were assessed. DNA was extracted from whole blood and used to measure epigenetic age (6CpG-EA), TL and LINE-1 methylation levels. The results showed that the 6CpG-EA was positively correlated with chronological age and negatively with TL and LINE-1 methylation. Despite no significant associations were detected with the overall diet quality (HEI), the 6CpG-EA was correlated with dietary intakes of the nutrients involved in the 1 C metabolism, especially in the western diet group, and with circulating TMA levels, especially in the healthy diet group. Overall, these results confirm that the 6CpG epigenetic clock is an easy tool to estimate biological age, in accordance with other molecular markers of aging, and suggest that the EA can be modulated not only by the micronutrients involved in the 1 C metabolism, but also by circulating levels of TMA. Despite TMA is a well-known uremic toxin up to date most of the scientific attention has been conveyed onto the harmful effects of TMAO and its role in several complex diseases. However, recent studies have reproposed a potential effect of TMA in boosting the pro-inflammatory response. Thus, since colonic epithelial cells are the first target of TMA’s effects (TMA is mainly produced in the colon), the third part of the project (Chapter 4) aimed to better elucidate the impact of excess intestinal TMA on intestinal epithelial cells, using colon adenocarcinoma Caco-2 cell line as an in vitro model. Given the prominent role of mitochondria in inflammation, the effect of TMA on mitochondrial dynamics was investigated, focusing on perturbation of ATP production and cellular membrane potential, as well as on the markers of mitochondrial damage (i.e., mtDNAcn, mt-cfDNA). Moreover, since a well-established link between inflammation and epigenetic perturbations exists, the effect of TMA on the expression levels and activity of DNA methyltransferases (DNMTs) and sirtuins (SIRTs), two key enzymes in the epigenetic landscape, was also examined. Lastly, a simplified model of intestinal epithelium was set up to preliminary evaluate the influence of TMA on intestinal permeability. Results showed that excess TMA in the intestinal environment may induce inflammation in intestinal cells (as demonstrated by the increased expression of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-1β) and perturb both epigenetic and mitochondrial homeostasis. Following the activated pro-inflammatory status, overwhelmed mitochondria may experience impaired mtDNA replication (as evidenced by the altered D-loop methylation and reduction of the mtDNAcn), which may compromise mitochondrial respiration (as proved by the downregulation of some respiratory chain components and decreased ATP content). Even though the intestinal permeability was not affected by TMA, this study certainly contributes to reinforcing the hypothesis that TMA (at least at high doses tested in the study) is not a harmless metabolite and it may have a contributing role in microbiota-induced intestinal diseases. Alterations of TMAO metabolism and mitochondrial dynamics have been previously independently identified as risk factors for the development of cardiovascular disease (CVD). Thus, mitochondrial DNA copy number (mtDNAcn) and the circulating levels of TMAO have been suggested as promising biomarkers of cardiovascular events. Hence, this fourth part of the project (Chapter 5) was aimed to identify biomarkers that could be predictive of CVD. Circulating levels of TMA, TMAO, and mtDNAcn were investigated in the whole blood in a population of 389 coronary artery disease (CAD) patients and 151 healthy controls, in association with established risk factors for CVD (i.e., sex, age, hypertension, smoking, diabetes, glomerular filtration rate (GFR)) and troponin, a marker of acute myocardial injury. Results showed that mtDNAcn was significantly lower in CAD patients; it was correlated with GFR, hypertension, and TMA, but not with TMAO. Moreover, high TMA levels were associated with high TMAO levels only in CAD patients and not in controls, which corroborates the hypothesis that TMA levels are not linked per se to high TMAO levels, but a different metabolism of TMA and TMAO in the presence of cardiovascular disease may exist. Interestingly, a biomarker including mtDNAcn, sex, and hypertension (but neither TMA nor TMAO) emerged as a good predictor of CAD from this study. Hence, these findings recognize only mtDNAcn as a promising biomarker to monitor the exposure to risk factors and the efficacy of preventive interventions for personalized CAD risk reduction. Several hypotheses have been proposed to explain the involvement of TMAO in the development of atherosclerosis and CVD risk. Among them, the induction of an inflammatory status has been proposed, with increased circulation of pro-inflammatory monocytes and the promotion of endothelial dysfunction. Nevertheless, contrasting evidence is emerging on TMAO role in CVD development and even a beneficial and protective role of TMAO has been hypothesized. Moreover, plasma TMA levels are recently gaining attention in cardiovascular health studies, since it seems that TMA may increase arterial blood pressure and exert toxic effects on vascular smooth muscle cells. Thus, this last section of the project (Chapter 6) was aimed to better elucidate the supposed pro-inflammatory actions of TMA and TMAO on circulating macrophages, using THP-1 monocytes as an in vitro model. Whether plasma TMA and TMAO may trigger the pro-inflammatory cascade was investigated and, considering the prominent role that mitochondria have in inflammation, the impact of TMA and TMAO on mitochondrial dynamics was also examined, focusing on perturbation of ATP production and cellular membrane potential, as well as on the markers of mitochondrial damage (i.e., mtDNAcn). Results revealed that both TMA and TMAO, were able to trigger inflammatory pathways in macrophages (as proved by the increased expression of the pro- inflammatory IL-8). However, TMA, more than TMAO, may disturb cellular homeostasis by altering mitochondrial dynamics as shown by the depletion of the intracellular ATP storage and by the upregulation of several components of the respiratory chain. Altogether, these findings contribute to reinforcing the hypothesis that TMA might be more detrimental than its oxidized product (TMAO) in the context of vascular inflammation and that TMA, more that TMAO, may have a contributing role in CVD, even though the exact mechanisms remain to be fully elucidated.

L'obiettivo primario del progetto di dottorato è stato quello di approfondire l'impatto sulla salute umana di due metaboliti di origine alimentare, ossia la trimetilammina (TMA) e l’ossido di trimetilammina (TMAO). TMA e TMAO derivano dal metabolismo di alcuni precursori alimentari ad opera del microbiota intestinale e i loro livelli ematici sono stati associati a malattie croniche. Tuttavia, ci sono delle opinioni contrastanti su questo argomento e ad oggi ancora manca una spiegazione meccanicistica su questa associazione. Pertanto, il presente lavoro ha voluto studiare l'impatto di TMA e TMAO sulla salute umana trattandolo da prospettive diverse, ed ognuna di esse corrisponde a una sezione di questo manoscritto. Poiché è stato ipotizzato che gli effetti di TMA e TMAO siano mediati dal loro impatto sulle dinamiche mitocondriali, la prima parte del progetto (Capitolo 2) ha voluto approfondire la relazione tra dieta, TMA, TMAO, numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNAcn) e metilazione del DNA mitocondriale. È stata presa in considerazione anche la metilazione globale del DNA. Per lo studio sono stati reclutati 200 soggetti sani con abitudini alimentari estreme (che seguivano una dieta sana o di tipo occidentale). Dai loro diari alimentari sono state estrapolate l’assunzione di nutrienti e la qualità delle loro diete (Healthy Eating Index). Sono stati misurati anche i livelli ematici di TMA e TMAO, i livelli circolanti dei precursori del TMA e il loro apporto nutrizionale. Sono stati valutati il mtDNAcn, i livelli di metilazione del DNA nucleare (nel retrotasposone LINE-1) e i livelli di metilazione dell’area D-loop nel DNA mitocondriale. Dai risultati è emerso che il rapporto TMAO/TMA correla negativamente con i livelli di metilazione del D-loop mitocondriale e positivamente con il mtDNAcn. Nel complesso, questi risultati supportano l'esistenza di una potenziale relazione tra il metabolismo del TMA e le dinamiche mitocondriali (e mtDNA), indicando una nuova strada per studi futuri. Nella seconda parte del progetto (capitolo 3) è stato approfondito l'impatto che diversi fattori ambientali (tra cui dieta, attività fisica e fumo) possono avere sull'età biologica. Infatti, è noto che lo stile di vita influenza la metilazione del DNA, accelerando o rallentando il processo di invecchiamento. Gli orologi epigenetici sono strumenti che, misurando i livelli di metilazione in specifiche aree del genoma, possono essere utilizzati per stimare l'età biologica di un individuo. Di recente, è stato proposto un nuovo orologio epigenetico che, basandosi sull’analisi di sole 6 CpGs, può rappresentare uno strumento facilmente accessibile per misurare l'età epigenetica (EA) di un individuo. Pertanto, l’obiettivo principale di questo studio è stato quello di poter convalidare questo semplice orologio epigenetico basato su 6 CpGs, confrontandolo con altri biomarkers di invecchiamento, ossia la lunghezza dei telomeri (TL) e la metilazione a livello del retrotasposone LINE-1 (usata come stima della metilazione globale del DNA). Inoltre, è stato approfondito anche l'impatto che alcuni fattori associati allo stile di vita (assunzione di nutrienti correlati al ciclo del carbonio (1C), livelli ematici di TMA e TMAO, composizione corporea, attività fisica e fumo) possono avere su questi biomarkers molecolari di invecchiamento. Hanno partecipato allo studio duecento soggetti sani che seguivano stili alimentari estremi (dieta sana o di tipo occidentale). Sono stati valutati gli apporti nutrizionali, i livelli circolanti di TMA e TMAO, la composizione corporea, il livello di attività fisica e l’abitudine al fumo. Dal sangue intero è stato estratto Il DNA e utilizzato per misurare l'età epigenetica (6CpG-EA) e i livelli di metilazione di TL e LINE-1. Dai risultati è emerso che la 6CpG-EA è correlata positivamente con l'età cronologica e negativamente con la metilazione di TL e LINE-1. Nonostante non siano state rilevate associazioni significative con la qualità complessiva della dieta (HEI), la 6CpG-EA è stata correlata con l'assunzione di nutrienti coinvolti nel 1C (specialmente nel gruppo che seguiva una dieta di tipo occidentale) e con i livelli ematici di TMA specialmente nel gruppo che seguiva una dieta sana. Nel complesso, questi risultati confermano che l'orologio epigenetico basato su 6CpGs può essere usato per stimare l'età biologica di un individuo, in accordo con altri marcatori molecolari dell'invecchiamento, e suggeriscono che la 6CpG-EA può essere influenzata non solo dai micronutrienti coinvolti nel 1C, ma anche dai livelli ematici di TMA. Nonostante il TMA sia una nota tossina uremica, ad oggi la maggior parte dell'attenzione scientifica è stata rivolta agli effetti dannosi del TMAO e al suo ruolo in diverse malattie “non comunicabili”. Tuttavia, studi recenti hanno proposto che la specie nociva sia in realtà il TMA, piuttosto che il TMAO, e hanno ipotizzato una sua possibile implicazione nel favorire uno stato infiammatorio. Pertanto, poiché le cellule epiteliali del colon sono il primo bersaglio degli effetti del TMA (prodotto principalmente nel colon), la terza parte del progetto (capitolo 4) ha avuto l`obiettivo di chiarire l'impatto dell'eccesso di TMA intestinale sulle cellule epiteliali del colon, utilizzando cellule di adenocarcinoma Caco-2 come modello in vitro. Considerato il preminente ruolo dei mitocondri nell'infiammazione, è stato studiato l'effetto del TMA sulle dinamiche mitocondriali, in particolare sulla perturbazione della produzione di ATP e del potenziale della membrana cellulare, nonché sui biomarkers di danno mitocondriale (ad es. copie del DNA mitocondriale (mtDNAcn) e DNA mitocondriale circolante (mt-cfDNA)). Inoltre, poiché esiste un legame consolidato tra infiammazione e perturbazioni epigenetiche, è stato anche esaminato l'effetto de TMA sui livelli di espressione e sull'attività delle DNA metiltransferasi (DNMTs) e delle sirtuine (SIRTs), due enzimi chiave nel panorama epigenetico. Infine, è stato messo a punto un modello semplificato di epitelio intestinale per valutare a scopo preliminare l'influenza del TMA sulla permeabilità intestinale. I risultati hanno mostrato che l'eccesso di TMA nel lume intestinale può indurre infiammazione nelle cellule intestinali (come dimostrato dall'aumentata espressione delle citochine pro-infiammatorie IL-6 e IL-1β) e perturbare l'omeostasi epigenetica e mitocondriale. A seguito dell’attivato stato pro- infiammatorio, la replicazione del mtDNA può risultare compromessa (come evidenziato dall'alterata metilazione del D-loop e dalla riduzione del mtDNAcn), e a sua volta può compromettere la respirazione mitocondriale (come dimostrato dalla diminuzione dell’espressione di alcuni componenti della catena respiratoria e del contenuto di ATP). Anche se la permeabilità intestinale non è risultata influenzata dal TMA, questo studio contribuisce certamente a rafforzare l'ipotesi che il TMA (almeno alle alte dosi testate nello studio) non sia un metabolita innocuo e che possa contribuire all’insorgenza delle malattie intestinali legate all’attività del microbiota. Le alterazioni del metabolismo del TMAO e delle dinamiche mitocondriali sono state precedentemente identificate in modo indipendente come fattori di rischio per lo sviluppo di malattie cardiovascolari (CVD). Pertanto, il numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNAcn) e i livelli ematici di TMAO sono stati suggeriti come promettenti biomarkers di eventi cardiovascolari. Perciò, questa quarta parte del progetto (capitolo 5) ha avuto lo scopo di identificare dei biomarkers predittivi di CVD. I livelli circolanti di TMA, TMAO e mtDNAcn sono stati studiati nel sangue intero in una popolazione di 389 pazienti con malattia coronarica (CAD) e 151 controlli sani, in associazione a noti fattori di rischio per CVD (cioè sesso, età, ipertensione, fumo, diabete, velocità di filtrazione glomerulare (GFR)) e troponina, un marker di danno miocardico acuto. Dai risultati è emerso che il mtDNAcn è significativamente più basso nei pazienti con CAD; inoltre è emersa una correlazione tra il mtDNAcn e GFR, ipertensione e TMA, ma nonTMAO. Inoltre, alti livelli di TMA sono stati associati ad alti livelli di TMAO solo nei pazienti con CAD e non nei controlli, il che avvalora l'ipotesi che i livelli ematici di TMA non siano di per sé legati a livelli elevati di TMAO, e che quindi si può verificare un’alterazione del metabolismo di TMA e TMAO in presenza di patologia cardiovascolare. Inoltre, dallo studio è emerso che il mtDNAcn, insieme a sesso e ipertensione (ma né TMA né TMAO), può essere considerato un buon predittore di CAD, utile anche per monitorare l'efficacia degli interventi preventivi per la riduzione personalizzata del rischio cardiovascolare. Sono state proposte diverse ipotesi per spiegare il coinvolgimento del TMAO nella promozione dell'aterosclerosi e del rischio CVD. Tra questi, vi è l'induzione di uno stato infiammatorio, caratterizzato dall’aumento di monociti pro-infiammatori in circolo e da disfunzione dell’epitelio vascolare. Tuttavia, ci sono opinioni contrastanti sul ruolo del TMAO nello sviluppo di CVD, ed è stato addirittura ipotizzato un ruolo benefico e protettivo del TMAO nei confronti del danno vascolare. Perciò recentemente si è iniziato a porre l’attenzione sui livelli plasmatici di TMA, poiché sembra che il TMA possa aumentare la pressione arteriosa ed essere tossico per la muscolatura liscia dei vasi sanguigni. Pertanto, quest'ultima sezione del progetto (capitolo 6) ha avuto come obiettivo quello di chiarire la presunta azione pro-infiammatoria di TMA e TMAO sui macrofagi circolanti, ed allo scopo sono stati utilizzati i monociti THP-1 come modello in vitro. Inoltre, considerando il ruolo di primo piano che i mitocondri hanno nel processo infiammatorio, è stato anche esaminato l'impatto di TMA e TMAO sulle dinamiche mitocondriali, in particolar modo sul potenziale di membrana, sulla produzione di ATP e sui marcatori di danno mitocondriale (mtDNAcn). Dai risultati è emerso che sia la TMA che il TMAO sono in grado di innescare una risposta infiammatoria nei macrofagi circolati (come dimostrato dall'aumentata espressione di IL- 8). Tuttavia, il TMA, più del TMAO, può disturbare l'omeostasi cellulare alterando l’omeostasi mitocondriale come dimostrato dalla riduzione delle riserve intracellulari di ATP e dalla sovraregolazione di diversi componenti della catena respiratoria. Complessivamente, questi risultati contribuiscono a rafforzare l'ipotesi che il TMA potrebbe essere più dannoso del suo prodotto ossidato (TMAO) nel contesto dell'infiammazione vascolare e che il TMA, più che il TMAO, possa contribuire all’insorgenza di CVD, anche se i precisi meccanismi molecolari rimangono ancora da chiarire.