EVIDENZA ULTRASTRUTTURALE E BIOMOLECOLARE DI ORGANISMI MIDICHLORIA-LIKE (MLO) IN TESSUTI DI TROTA IRIDEA E POSSIBILE RUOLO NELL’EZIOLOGIA DELLA RED MARK SYNDROME (RMS)

RMS e US SD sono malattie cutanee che colpiscono la trota iridea (O. mykiss) in molti paesi europei e negli Stati Uniti. L’eziologia di queste malattie è ancora incerta. A dispetto di indagini specifiche che individuano la presenza di DNA correlato a Rickettsia-like organisms (RLOs) in trote allevate negli Stati Uniti e in Europa (Lloyd et al., 2008; Metselaar et al., 2010), e più recentemente di DNA correlato a Midichloria-like organism (MLOs) in trote allevate in Scozia (Cafiso et al., 2015), questi agenti patogeni non sono mai stati rilevati morfologicamente. La presente ricerca rappresenta la prosecuzione di indagini condotte negli ultimi anni su focolai di RMS in Italia, finalizzate a comprendere la patogenesi e l’agente causale della malattia. A tal fine sono state campionate 17 trote con lesioni riferibili a RMS presso due allevamenti del nord Italia, con ricorrenti episodi di malattia, e 5 trote di controllo dallo stabulario ittico dell’Università di Udine, nel quale non sono mai stati segnalati episodi di RMS. Su campioni di cute e milza di tutti i soggetti sono state effettuate indagini istologiche, ultrastrutturali e biomolecolari. L’esame istologico ha evidenziato il tipico quadro di massiva infiltrazione linfocitomacrofagica coinvolgente tutti gli strati cutanei, talvolta fino al sottostante tessuto muscolare. L’indagine ultrastrutturale, effettuata con un microscopio elettronico Zeiss EM 109, ha evidenziato nel 59% dei soggetti la presenza di microrganismi ovali o allungati, di dimensioni di lunghezza pari a 400 -700 nm e di larghezza pari a 100-200 nm, con citoplasma granulare elettrondenso, parete trilaminare, con membrana esterna e interna, tipica dei batteri Gram-. Alcuni mostravano una struttura filamentosa, riferibile a DNA, disposta ad un polo del batterio. Nelle 5 trote di controllo non sono stati evidenziati microrganismi intracellulari. I batteri erano sempre intracellulari, localizzati in fibroblasti, eritrociti, macrofagi, raramente nei neutrofili. Previa estrazione del DNA, l’indagine biomolecolare è stata effettuata in due step: PCR con due primers messi a punto da Lloyd (RLO1 e RLO2), sull’amplificato è stata condotta una successiva PCR con due primers messi a punto dagli autori (RiFCfw e RiFCrev). Dopo la seconda amplificazione è stata ottenuta una banda di piccole dimensioni, molto definita, di 188 Kbp, evidenziata nella cute e nella milza del 76% delle trote. Nessuna delle 5 trote di controllo ha evidenziato la stessa positività. Le caratteristiche ultrastrutturali permettono di assimilare i microrganismi individuati quali appartenenti a Rickettsiales: in questo ordine le famiglie Rickettsiaceae e Midichloriaceae appaiono molto affini. Il confronto con la morfologia ultrastrutturale di altri batteri appartenenti alla famiglia Midichloriaceae (Fritsche et al., 1999 ; Sacchi et al., 2004; Sassera et. al 2006; Vannini et al., 2010) individua una forte somiglianza tra questi batteri e quelli rinvenuti nella presente indagine. Inoltre i risultati dell’indagine biomolecolare supportano tale ipotesi in quanto i primers RiFCfw e RiFCrev, messi a punto nei nostri laboratori, sono in grado di riconoscere sia la sequenza del DNA 16s di Rickettsia-like organism, che la sequenza di DNA 16s di Midichloria-like organism. I risultati ultrastrutturali e biomolecolari, associati alla recente individuazione di positività per DNA correlato a MLO in trote affette da RMS in Scozia (Cafiso et al., 2015), ci permettono di sostenere che i batteri intracellulari da noi rinvenuti in tessuti di trote affette da RMS in Italia, possano essere riferibili a Midichloria-like organisms, e che questi organismi possono essere ritenuti gli agenti causali di RMS.